V muzeu Smithsonian institut ve Washingtonu nastala noc. Strážci odešli domů, světla zhasla, dětští návštěvníci jsou doma ve svých postelích... přesto je v "prázdném" muzeu podivný šramot. Bývalý noční hlídač Larry Daley (Ben Stiller) je opět zatažen do těžko představitelného dobrodružství, ve kterém ožívá sama historie. Ve druhém pokračování ságy Noc v muzeu je Larry nucen čelit bitvě tak velkolepé, že se může odehrávat pouze v rozlehlých chodbách největšího muzea na světě. Larry se musí pokusit zachránit své někdejší neživé přátele, kteří se náhle ocitli v ohrožení mezi dalšími muzejními skvosty, z nichž všechny - od slavných obrazů na stěnách po vesmírné lodě v halách – náhle dostaly svůj rozum.